蛋白免疫印迹（WB）：基于抗原抗体的特异性结合作用，以检测复杂样品中的某种蛋白，并对其进行半定量分析的一种方法。
主要用于靶标蛋白特异性表达的定性或半定量分析，蛋白与蛋白或蛋白与DNA相互作用的后续分析，以及蛋白修饰的鉴定分析。
很多在实验室做实验的科研君都会碰到不完美的实验结果，由于某一步没有做好或没有注意就浪费两天宝贵的时间，走了不少弯路，今天小编就在这里给大家总结一下WB实验中遇到的问题并附上解决方法。
常见问题原因分析及解决办法
一、高背景
| 可能原因 | 解决办法 |
| 封闭不充分或封闭液不合适 | 选择合适封闭液，并优化封闭条件时间与温度 |
| 抗体孵育浓度过高，孵育时间过长或温度过高 | 优化抗体孵育浓度与时间 |
| 洗涤不充分 | 洗涤次数和时间适当延长 |
| 二抗非特异性结合 | 设置二抗对照，并选择合适的二抗试剂 |
| 干膜 | 操作过程中保持膜湿润状态 |
| 膜污染 | 操作过程保持膜整洁，不要用手按压膜的任何部位 |
| 发光底物过度残留 | 吸干多余发光液后进行显影 |
| 显影时间过长 | 压胶片时间长短适宜，在显影液中不要停留太长时间 |
二、无目的条带
| 可能原因 | 解决办法 |
| 样本中所含目的蛋白表达量过低或无表达 | 确认样本可行性，对表达过低的样本进行富集后再进行实验；更换超敏ECL并适当延长曝光时间 |
| 蛋白提取时降解 | 蛋白提取时，保持低温状态，并加入相应的蛋白酶抑制剂 |
| 蛋白样本保存条件不合适，蛋白降解 | 蛋白样本建议加入。上样缓冲液煮沸变性后保存，对于稀有样本建议分装于-80°C保存；避免反复冻存，尽快完成检测 |
| 蛋白转膜效率低 | 丽春红染色确认转膜体系是否正常 |
| 抗体孵育浓度过低或时间过短 | 优化抗体孵育量，一抗建议4℃ 过夜孵育 |
| 一抗二抗检测体系不匹配 | 选择合适的一抗二抗 |
| 抗体失活 | 正确保存抗体 |
| 显影液使用时间过长 | 使用新鲜试剂，并避光保存 |
三、条带大小与理论值位置不符
| 可能原因 | 解决办法 |
| Marker指示大小偏差 | 选择合适的预染Marker,并与非预染 Marker对比，观察差异大小 |
| 电泳体系影响 | 避免边缘孔的不稳定因素，在中间孔上样，边缘孔加入等量上样缓冲液平衡体系 |
| 翻译后修饰 | 查阅文献，确认蛋白本身是否存在磷酸化或糖基化等修饰 |
| 翻译后剪切及异构体 | 查阅文献，确认蛋白是否存在多种剪切活性形式 |
| 蛋白多聚体形成 | 蛋白二聚体或多聚体形成，在样本制备过程中，使用新鲜的DTT或β-巯基乙醇，保持蛋白单体状态 |
| 蛋白相对电荷变化 | 蛋白氨基酸组成不同，某些蛋白所盖，导致蛋白迁移率与蛋白大小不盖，导致蛋白迁移率与蛋白大小不成正比 |
四、其它问题
| 可能原因 | 解决办法 |
| 反影或膜上可见黄色条带 | 一抗二抗抗体浓度过高或样本上样量过大，导致酶被瞬间消耗 |
| 白色空点 | 转膜三明治制备时有气泡，或者抗体孵育不均匀，应在摇床上孵育 |
| 黑色斑点背景 | 封闭液颗粒残留，在使用前应充分搅拌溶解 |
| 微笑条带 | 条带迁移过快，降低电压； 胶凝固不均匀，正确制备凝胶 |
| 皱眉条带 | 电泳时，电泳丝底物聚集大量气泡，导致电压不均衡 |
| 条带拖尾 | 样品内有不溶物，离心或者优化样本蛋白提取；上样量过载，降低上样量；使用凝胶浓度不合适，蛋白分辨率较低，调整交联剂比例；电泳液反复使用多次，重新配置新鲜电泳液 |
| 条带扭曲 | 胶界面不平导致歪斜或凝胶制备不均匀；样本中盐离子浓度过高，干扰电泳；电压过高，电泳迁移过快 |
| 条带粘连，无孔间间隙 | 胶没凝好，蛋白上样量过大 |
