蛋白质定量貌似简单的实验，其实还是有一些学问的，蛋白质测定的方法有很多种，到目前为止还没有哪种方法符合大众所有的要求的，主要分为Bradford斑点试验、Coomassie斑点试验、紫外分光度检测法以及BCA法。那今天恒远小编就一一的给大家一一解析这其中的奥秘原理，欢迎您的查阅与参考！
一、Bradford法
该方法用于大多数蛋白质定量是相当精确的，特别是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污剂的浓度超过0。2%则影响定量结果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。
1.Bradford染液配制：将100mg考马斯亮蓝溶于50ml95%的乙醇中，加入100ml浓磷酸，然后，用双蒸水补充至200ml，放4C至少6个月；
2.作标准曲线的蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准蛋白，例如进行抗体定量，可用纯化的抗体作为标准蛋白。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg-150μg/100μl之间绘制标准曲线；
3.将待测样本溶于100μl缓冲溶液中，该缓冲溶液应于作标准曲线的缓冲溶液相同；
4.按1：5用双蒸水稀释浓染料结合溶液，过滤离心沉淀物；
5.每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5-30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，即可在595nm光波长下测定其吸光度。注意，颜色反应不得超过30min；
6.标准曲线计算待测样本的浓度。注意：应用Bradford法测定BSA的值是其重量的两倍。
二、Bradford斑点试验
该方法特别适用于检测洗脱组分，以定位蛋白洗脱液。例如检测洗脱液的吸附力的强弱。
1.首先，浓缩Bradford染液。将100mg考马亮蓝溶于50ml95%的乙醇中，加入100ml浓磷酸，然后，用双蒸水补充至200ml，放4C至少6个月。这种染液也可从Bio-Rad公司购到；
2.将8μl待测蛋白质样本转移至一条Parafilm，SaranWrap上或微孔板孔中。同时应设一洗脱液样本作为空白对照；
3.每个样本孔中加2μl浓Bradford染液并混匀；
4.大约2min后，含有蛋白质的样本将变蓝。该方法的灵敏度约为10μg/ml。此反应对去污剂的浓度超过0。2%时非常敏感。但KCl，NaCl，MgCl2或EDTA对其无影响，Tris对其仅有轻微的影响。
三、Coomassie斑点试验
该方法特别适用于检测洗脱组分以定位蛋白洗脱液。例如检测洗脱液的吸附力的强弱。
1.裁剪3MM厚的Whatman纸约4mm2；
2.每个样本点5μl于Whatman纸上；
3.自然干燥样本或用电吹风吹干斑点，约1min或更少；
4.将纸块浸入0。25%的考马斯亮蓝溶液中(考马斯亮蓝溶于10%的甲醇，7%醋酸中)30min；
5.将纸块放入10%的甲醇，7%醋酸溶液中洗涤3-5min，然后干燥。
四、紫外分光度检测法
蛋白质紫外光吸光率是所有的蛋白质定量方法中最快的方法。通常在280nm光波长下读数。其在280nm光波长下的最大吸光率主要处决于酪氨酸和色氨酸的存在。在205nm光波长的吸收也常用到。其在205nm光波长下的最大吸光率主要处决于肽链，尽管氨基酸也有影响。另外，一个主要的优点是在测定蛋白质浓度时，样本不会遭到损害。
1.纯蛋白质溶液：
①在280nm光波长下读取与适当的对照相比较的吸光率；
②对于抗体和BSA，可应用下表计算其浓度对其他蛋白质可粗约地估计：
1个单位吸光率相当于1mg/ml、蛋白质A280(1mg/ml)、IgG1.35、IgM1.2、BSA0.7
2.含有核苷酸的蛋白质溶液
①在280nm和260nm或280nm和205nm光波长下读取与适当的对照相比较的吸光率；
②用下列等式粗略计算其浓度：
蛋白质浓度(mg/ml)=(1。55×A280)-(0。76×A260)
蛋白质浓度(mg/ml)=A205/(27+120A280/A205)
五、BCA法：
由标准曲线可以算出样品原始浓度为14。28mg/ml
BCA法特点：
1.灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0。5μg，待测样品体积为1-20μl。
2.测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的TritonX-100，5%的Tween20，60，80。
3.在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。
4.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。
5.受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM
BCA法和Commassie法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。
Bradford法、Coomassie法、紫外分光度检测法以及BCA法各有优缺点，要根据实验的目的去选择合适的蛋白定量方法，主要依据是缓冲液的化学组成和待测的蛋白的浓度。
上海恒远帮您轻松搞定实验，打造国内ELISA试剂盒龙头企业，我司可提供上万种ELISA试剂盒及其相关科研产品，检测对象有抗凝全血、多纤维全血、各种动植物血浆（血清）等，以生产高品质、低价格的产品为已任，受到众多所科研单位青睐。
