ELISA标准曲线的绘制要点及结果处理方法

许多试剂检测都涉及到标准曲线的问题，标准曲线做的好与坏会直接影响到实验的结果，甚至是关系到实验的成败，那么究竟如何绘制或制作标准曲线呢？

首先我们需要了解下标准曲线中的问题：

标准曲线不正确

标准品冻干粉溶解体积错误

确保冻干粉用正确的体积溶解，溶解体积在说明书或小瓶上标有。

溶解时间太短

确保溶解时间足够长让冻干粉充分溶解。

浓缩标准品稀释错误

确保浓缩标准品根据说明书要求正确稀释。

材料/预稀释液保存有误

标准液和预稀释液的保存按照说明书要求。

标准品稀释时不正确混匀

浓缩标准品连续稀释并正确混匀。

检测波长错误

确保检测时光度计的波长是正确的。

使用其他试剂盒的标准品

只能用试剂盒提供的标准品做实验，不能用其他试剂盒的标准品替代。

其次做标准曲线样品检测时有几个问题需要注意

1、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的，所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事，否则后面的实验结果无从谈起。

2、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度，即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内，包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。

3、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

4、检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。

5、标准曲线的样品数一般为7个点，但至少要保证有5个点。

6、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动，但一般来说，相关系数R至少要大于0.98，对于有些实验，至少要0.99甚至是0.999.

1. ELISA实验中样品都要做复孔或三孔，然后计算每个浓度标准品的平均OD值，复孔的变异系数应该小于20%。

2. 平均OD值减去空白孔的OD值。

3. 制作标准曲线。

    以减去本底后的OD值为X轴，标准品的浓度为Y轴，利用作图软件得出一个合适的计算方法。建议使用合适的软件来作图，比如CurveExpert 1.4。这款软件能够给出很多种方法（比如直线、半对数、对数、四参数方程等）并从中选择一条最合适的方程。要想检验某条曲线是否与表中数据吻合，可以将标准品的浓度作为未知数，将对应的OD值带入该方程，计算出标准品的浓度，得到的结果应该与实际浓度很接近（+/-10%）。选择拟合度最高的那条曲线。

以下是CurveExpert1.4的使用过程：

① 将OD值和标准品浓度数据复制粘贴到表格中

② 生成和选择标准曲线

 

③ 通过曲线计算样品浓度

 

输入OD值，点击“计算”按钮，得到样品的准确浓度。

 或者得到相关方程，通过excel来计算浓度。

 

  如果需要导出方程，可点击“复制”，粘贴至excel中。

④ 对于OD值落在标准曲线之外的情况

    如果样品的OD值超过标准曲线的最高值，在实验前应该先将样品稀释从而得到准确的浓度。样品的最终度应该是计算出的浓度乘以稀释倍数。