在做ELISA试剂盒实验过程中，难免会遇到各种不同的问题，比如标准曲线不好，试剂盒的回收率，假阴性，假阳性，实验的重复性不好等等。ELISA试剂盒现在就来一一解答用户们在实验过程中遇到的各种疑问！
ELISA试剂盒曲线问题： 

1.OD值不正常

试剂盒未回温，试剂盒回温到25℃

温度控制不好，控制正确温度

孵育时间不准确，控制孵育时间

洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增 加，洗涤4-5次，每孔250ul，然后拍干

阳光直射，对着风直接吹，避风避

酶标仪的波长错误，酶标仪的波长450nm

抗体的稀释错误，正确的稀释抗体

水质问题，用娃哈哈矿泉水代替

2.白   板

洗涤液配制错误，正确的配制洗涤液

少加液体（错加液体），正确的步骤加液体

3.无 梯 度

标准品也污染，换标准品点板

OD值不正常，控制温度时间在做一次

人为点板，不要点板

4.线 性 不 好

OD值不正常，控制温度时间在做一次

ELISA试剂盒回收率

1.空白管阳性高

样本本身就是阳性样本，换阴性样本做回收率

空白管在实验中被污染，实验中防止交叉污染

水质原因用，娃哈哈矿泉水代替

2.偏  高

添加量不准确，精准的添加量

添加浓度不适合，ELISA试剂盒添加合适的浓度

取液吹干量多，准确的取液吹干

取到其它相层液体，取需用相吹干

复溶液未稀释或加入量少，正确的稀释复溶液

ELISA试剂盒3.偏  低

添加量不准确，精准的添加量

添加浓度不适合，添加合适的浓度

取液吹干量少，准确的取液吹干

复溶液稀释错误或加入量多，正确的稀释复溶液

假阴、阳性

1，水质原因：点复溶液验证，用娃哈哈矿泉水代替

2，实验操作原因

吸取到其它相吹干，准确的取液吹干

离心不彻底，延长离心时间

样本的污染，更换样本

乳化未处理完全，温浴（70℃）处理乳化现象

3，仪器试剂原因

离心管未清洗干净，正确的洗涤器具

有机溶剂的影响，ELISA试剂盒做试剂空白看影响结果

4，衍生化试剂原因（长时间衍生化试剂变质）,更换衍生化试剂

5，与曲线好坏相关,，保证曲线的正常

4．边缘效应
使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应"，即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温(通常在25℃左右)置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度(如37℃)，就可以很容易地排除“边缘效应"，并且可提高测定的重复性。
5．加样
在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。