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组织常用固定剂和固定方法

点击次数:1329次     发布时间:2015/6/26 15:00:58

1.甲醛  是常用的醛类固定剂,甲醛(formaldehyde)通过与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团,如氨基、羟基、酰氨基等结合,使蛋白多肽分子间形成亚甲基桥(-CH2 -),蛋白质不再发生改变,保存原位。其特点是组织形态结构保存好,穿透性强,组织收缩少。但是,醛基与抗原蛋白 氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的空间构象发生改变,分子间交联形成的网络结构可能部分和完全遮盖抗原决定簇,使之不能完全暴露,因此,在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。如果固定后能够充分水洗,可减少分子间交联。在免疫组织化学染色之前切片通过抗原修复还可使抗原再现。为减少固定剂与抗原的交联,在使用醛类固定剂时,应缩短固定时间(8~24小时),降低固定温度(4℃)。由于上述缺点可以通过一定处理加以纠正,因此甲醛是首选固定剂。
    (1)10%中性缓冲福尔马林:商品试剂常为37%一40%甲醛水溶液,常按1:9比例使用,但甲醛的实际浓度为4%[配法:甲醛原液10ml,0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)90ml混匀。
    (2)4%多聚甲醛磷酸缓冲液(多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS 500ml,两者混合加热至6℃,搅拌并滴加1N NaOH至清澈为止,冷却后加PB至总量1000m1)。
    2.丙酮  为无色极易挥发和易燃的液体,丙酮(acetone)渗透力很强,能使蛋白质沉淀凝固,但不影响蛋白质的功能基团而保存酶的活性,用于固定磷酸酶和氧化酶效果较好。缺点是固定快、渗透力强,易使组织细胞收缩,保持细胞结构欠佳。一般4℃下30~60分钟为宜。
    3.醇类  性能与丙酮基本相同,有固定和脱水的双重作用,穿透力快,组织块收缩明显,硬化力强。用冷液能较好地保存酶和抗原的免疫活性,但醇类对低分子蛋白质、多肽及细胞质内蛋白质保存效果较差。解决的办法是与其他试剂混合使用。
    4.混合固定剂
    (1)Bouin液:先将饱和苦味酸750ml过滤,加入40%甲醛250ml,混合后存于4℃冰箱备用,临用前加入冰醋酸50ml。组织通常在4℃下固定6~8小时。此固定剂对肾脏结构保存不利。
    (2)Zamboni液:称取多聚甲醛20g,加入饱和苦味酸150ml,加热至60~C左右,持续搅拌,使之完全溶解。过滤、冷却后加Karasson-Schwh磷酸缓冲液(NaH2 PO4 ・H2 O3.31g,Na2 HPO4 ・7H2 0 33.77g,加双蒸水至1000m1)。该固定液可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。固定时间以6-18小时为宜。
    (3)AAF液:为较常用的固定液(95%一100%乙醇85ml,冰醋酸5ml,浓甲醛l0ml)。
    (4)Clarke改良固定剂(100%乙醇75ml,冰醋酸25m1),常用于冰冻切片的后固定。

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